蛋白的酵母双杂交实验——以钓饵蛋白筛选 cDNA 文库研究蛋白相互作用

第一部分 系统简介

1. 实验原理

蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础,研究反式作用因子之间的相互作用对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道,转录活化蛋白可以和 DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种 DNA 结合与转?#25216;?#27963;的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即 DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的,并且这两个结构域?#26434;?#22522;因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有 LexA 系统 Gal4 系统两种。在 LexA 系统中,DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白 LexA 构成,转录活化结构域则由一个 88 个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽 B42 构成,它在酵母中可以活化基因的转录 Gal4 系统中,BD  AD 分别由 Gal4 蛋白上不同的两个结构域(1-147aa  768-881aa)构成。在利用GAL4 系?#25104;?#36873; cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时,DNA 结合结构域与靶蛋白即诱饵”相结合,转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下,单独的 BD 可?#26434;?/span> GAL4 上游活化序列

GAL UAS结?#31995;?#19981;能引起转录,单独的 AD 则不能与 GAL UAS 结合,只有当 BD AD 分别表达的融合蛋?#23376;?#20110;相互作用而导致两者在空间上相互靠近时,BD  AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在 BD  AD 要导入的酵母菌AH109 中,通过基因工程的方法在 GAL4 UASs ?#25512;?#21160;子的下游构建了 3 个报道基因——ADE2HIS3MEL1

 LacZ,因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。

 
1. 系统特点

同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比,双杂交系统具有其独特优势。首先,融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行,蛋白质有可能保持天然的折叠状态,类似其在体内生理状态下的情况,这是其他离体生化检验方法所缺乏的,因此较之后者,它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于在体的真实水平。其次,双杂交系统的敏感度即高,可以检测到在蛋白质之间结合常数低至 1mmol/L 左右的微弱作用。许多微弱或短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报道基因表达过程中的多级放大效应反映出来;融合蛋白基因在?#31185;?#21160;子的作用下,处于?#32454;?#30340;表达水平。第三,在筛选 cDNA 文库时,双杂交系统能够简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列,它只需构建质粒而不必准备抗体或纯化蛋白,省略了其它体外检测蛋白之间相互作用方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。

需要指出的是,融合体蛋白必须转运至核内才能活化转录,因此?#26434;?#32990;外配体—受体作用以及需要核外修?#20301;?#21463;磷酸化等翻译后修饰过程介导的蛋白质间相互作用而言,该系统的应用受到一些限制。在进行文库筛选时,假阳性结果常常干扰实验的准确性,除某些文库编码的蛋白质本身含有转录活化成分外,细胞内的其它无关蛋白?#37096;?#33021;有类似作用,因此双杂交系统检测的结果必须通过其它蛋白间相互作用的实验来进一步验证。
 

第二部分 实验流程


一.培养基:

构建于 AD 载体的 cDNA 文库的扩增


LB 液体培养基,121℃,15 lbf/ in2 灭菌 15min

A. bacto-Tryptone 10.0g

B. bacto-Yeast Extract 5.0g

C. NaCl 5.0g

D. 5N NaOH  pH ? 7.0

本地图片,请重新上传

E. ddH2O ? 1000.0 ml

* LB 固体培养平板为含有 1.8%琼脂(Agar)的 LB 培养基

LB/Amp 培养基为含有 Amp 100 ug/ml(高?#36141;?#20919;却到 50℃加入)的 LB 培养基

 

 

二.实验步骤:

 

1. -70℃冰箱取出含有 DNA 文库的甘油菌,置于冰浴?#35874;?#24930;化?#24120;?/span>

 

2. 用新鲜的 LB 培养液在 1.5ml 离心管中将上述甘油菌 1:106  1:108 稀释;

 

3. 取稀释菌液各 10ul 加入 90ul LB 培养液在 1.5ml 离心管中振荡混匀,涂布 LB/Amp

 

平板(φ90mm); 37℃倒?#38376;?#20859;过夜或 30℃培养 24-36hr,计数平板?#31995;?#20811;隆菌落数;

 

4. 确定待扩增的 DNA 文库滴度cfu/ml=克隆数108(1:106  稀释)或克隆数1010(1:108稀释)

5. 按照>2-4104cfu/平板的浓度,涂布 LB/Amp 平板(φ150mm),共 100 块;37℃倒?#38376;?#20859;过夜;

6. 在超净台上,将所有生长菌落的平板上加适量 LB 培养液,将菌落刮下,转入 2000ml LB/ Amp 培养液中,37℃振荡培养 2-4hr;

7. 留取适量培养菌液以 50%无菌甘油稀释至 25%终浓度,分装,保存于-70;

 

8. 其余培养菌液 8000rpm10min, 4℃,收集细菌;用质粒 DNA 纯化试剂盒大量抽提质粒 DNA