CCK8全稱Cell Counting Kit-8試劑,可用于簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為:該試劑中含有WST-8[化學名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽],它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物(Formazan dye)。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。該試劑主要用途有:藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗

WST-8屬于MTT的升級產品,工作原理為:在電子耦合試劑存在的情況下,可以被線粒體內的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產物(formazan)。顏色的深淺與細胞的增殖成正比,與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450mM波長處測定OD值,間接反映活細胞數量。

CCK法應用非常廣泛,如藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗以及生物因子的活性檢測等。

CCK法的操作步驟

實驗一:細胞活性檢測

1、在96孔板中接種細胞懸液(100μL/孔),將培養板放在培養箱中預培養(37℃,5% CO2)。

2、向每孔加入10 μL CCK溶液(注意不要在孔中生成氣泡,它們會影響OD值的讀數)。

3、將培養板在培養箱內孵育1-4小時。

4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

5、若暫時不測定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定,吸光度不會發生變化。

實驗二:細胞增殖-毒性檢測

1、在96孔板中配置100μL的細胞懸液。將培養板在培養箱預培養24小時(37℃,5% CO2)。

2、向培養板加入10μL不同濃度的待測物質。

3、將培養板在培養箱孵育一段適當的時間(例如:6、12、24或48小時)。

4、向每孔加入10μL CCK溶液(注意不要再孔中生成氣泡,它們會影響OD值的讀數)。

5、將培養板在培養箱內孵育1-4小時。

6、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

7、若暫時不測定OD值,可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。24小時內測定,吸光度不會發生變化。

注意:如果待測物質有氧化性或還原性的話,可在加CCK之前更換新鮮培養基(除去培養基,并用培養基洗滌細胞兩次,然后加入新的培養基),去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下,可以不更換培養基,直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。

CCK8檢測實驗,咨詢:謝鵬 15837171623