在分子机制的研究中,蛋白和蛋白之间的互作研究可以说是非常经典了,因为在十几年前,大家对非编码RNA的研究还没有现在这么热,研究的分子是蛋白,找的靶分子?#24425;?#34507;白,研究的文章发在JBC杂志上的非常多。

有时在想,JBC作为老牌名刊,尽管杂志不能只看影响因子,?#36824;?#36817;几年影响因子怎么一直在?#30340;兀?#37117;快跌破4分了。当然,JBC不是今天的主题,我们主要说蛋白和蛋白作用。研究蛋白作用的方法有很多,今天我们介绍三个:酵母双杂交,CoIP和GST-pulldown。

酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid System,Y2H)
酵母双杂交技术是验证蛋白间相互作用的经典方法之一。原理是在真核细胞调控转录过程中的转?#25216;?#27963;因子GAL4的两个结构域:DNA结合域BD与转?#25216;?#27963;域AD在分离的时候不具有转?#25216;?#27963;功能,而当两者结合在一起才具有完整的转?#25216;?#27963;因子的功能。因此,我们将所要研究的目的基因(蛋白A和蛋白B)分别装载到这两个质粒载体中,两个结构域序列则分别与基因的ORF进行融合。当转入相应酵母菌株后,若在酵母内表达的不同蛋白发生互作,则将使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近结合,再进一?#25509;?#19978;游激活序列结合,激活相应报告基因的表达。

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)
免疫共沉淀是另一种研究蛋白相互作用的经典方法。原理是如果蛋白A与蛋白B(直接或间接)结合,那么当我们用抗体去结合蛋白A的时候,蛋白B?#26448;?#34987;拉下来;当然,反之亦然。因此,首先提取蛋白,然后在提取的蛋白中加入蛋白X的抗体,孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介质上),然后变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳,经过Western Blot检测蛋白B,当然,也可以直接将沉淀下来的蛋白通过质谱分析其它蛋白。

GST-pulldown
GST pulldown 是另一项验证蛋白相互作用的经典实验,其基本原理是将靶蛋白-GST(Glutathione-S-transferase?#20837;?#33527;肽巯基转移酶)融合蛋白亲和固化在?#20837;?#29976;?#37027;?#21644;树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过WB或者质谱进行检测和鉴定。

以上三种方法是研究蛋白互做最常用的三种方法,一般Y2H常用来筛选,Co-IP和GST pulldown用来验证。研究不仅在整体蛋白层面,还包括蛋白的结构域层面,GST pulldown是用来验证蛋白A与B的直接结合的,而Y2H和Co-IP结果则还有间接作用以及非特异性作用。