在分子機制的研究中,蛋白和蛋白之間的互作研究可以說是非常經典了,因為在十幾年前,大家對非編碼RNA的研究還沒有現在這么熱,研究的分子是蛋白,找的靶分子也是蛋白,研究的文章發在JBC雜志上的非常多。

有時在想,JBC作為老牌名刊,盡管雜志不能只看影響因子,不過近幾年影響因子怎么一直在降呢?都快跌破4分了。當然,JBC不是今天的主題,我們主要說蛋白和蛋白作用。研究蛋白作用的方法有很多,今天我們介紹三個:酵母雙雜交,CoIP和GST-pulldown。

酵母雙雜交(Yeast Two-Hybrid System,Y2H)
酵母雙雜交技術是驗證蛋白間相互作用的經典方法之一。原理是在真核細胞調控轉錄過程中的轉錄激活因子GAL4的兩個結構域:DNA結合域BD與轉錄激活域AD在分離的時候不具有轉錄激活功能,而當兩者結合在一起才具有完整的轉錄激活因子的功能。因此,我們將所要研究的目的基因(蛋白A和蛋白B)分別裝載到這兩個質粒載體中,兩個結構域序列則分別與基因的ORF進行融合。當轉入相應酵母菌株后,若在酵母內表達的不同蛋白發生互作,則將使GAL4-BD和GAL4-AD相互靠近結合,再進一步與上游激活序列結合,激活相應報告基因的表達。

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)
免疫共沉淀是另一種研究蛋白相互作用的經典方法。原理是如果蛋白A與蛋白B(直接或間接)結合,那么當我們用抗體去結合蛋白A的時候,蛋白B也能被拉下來;當然,反之亦然。因此,首先提取蛋白,然后在提取的蛋白中加入蛋白X的抗體,孵育后再加入Protein A或G(于Agarose 或magnetic beads等介質上),然后變性、聚丙烯酰胺凝膠電泳,經過Western Blot檢測蛋白B,當然,也可以直接將沉淀下來的蛋白通過質譜分析其它蛋白。

GST-pulldown
GST pulldown 是另一項驗證蛋白相互作用的經典實驗,其基本原理是將靶蛋白-GST(Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巰基轉移酶)融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當一種“誘餌蛋白”,目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白),洗脫結合物后通過WB或者質譜進行檢測和鑒定。

以上三種方法是研究蛋白互做最常用的三種方法,一般Y2H常用來篩選,Co-IP和GST pulldown用來驗證。研究不僅在整體蛋白層面,還包括蛋白的結構域層面,GST pulldown是用來驗證蛋白A與B的直接結合的,而Y2H和Co-IP結果則還有間接作用以及非特異性作用。