在过氧化物酶(peroxidasePOD)催化下,双氧水(H2O2)将愈创木酚氧化成茶褐色产物,此产物在 λ 470 nm处有最大吸收峰,故可以通过测其吸光度的变化测定过氧化物酶的活性。

1 试剂

10.05 mol/L 磷酸缓冲液(PBSpH 7.8

20.2 mol/L 磷酸缓冲液(PBSpH 6.0

32-甲氧基酚(愈创木酚)

430%双氧水(H2O2

2 实验方法

2.1 样品前处理

称取0.2 g样品置于预冷的研钵中,分三次加入6 ml2 ml2 ml2 ml)预冷的磷酸缓冲液(pH 7.8),在冰浴上研磨成匀浆,转入10 ml离心管中,低温12000 r/min离心20min,上清夜?#27425;?#37238;粗提液。

2.2 测定方法

1)反应混合液的配制:取100 ml磷酸缓冲液(pH 6.0)于烧杯中,加入38 μl愈创木酚(2-甲氧基酚)于磁力搅拌器上加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液冷后加入56 μl 30%的H2O2,混匀后保存于4℃备用。

2)酶活性测定:取3 ml反应混合液,加入35 μl酶液(可视情况调整)后测定470 nm下的吸光度,10 s测定一次,测定120 s。以PBSpH6.0)代替酶液作为对照调零。

2.3 计算公式

以每分钟内OD值变化(升高)0.01为一个酶活性单位(U)。按下式计算酶活性:

其中:

过氧化物酶活性以酶单位每克鲜重每分钟表示(U/g·min);

ΔA470为反应时间内吸光度的变化;

Vt为提取酶液总体积(ml);

Vs为测定时酶液用量(ml);

W为样品鲜重(g);

t为反应时间(min)。